:
افزون بر 20% از اراضی کشاورزی و نزدیک به نیمی از زمین های آبی در دنیا متأثر از مشکل شوری هستند که این، عامل محدود کننده رشد و نمو گیاهان در سراسر جهان و مشکلی جدی برای تولید محصول کشاورزی میباشد (28). شوری خاک یکی از مهمترین مشکلات محیطی است که تولید محصول زراعی را تحت تاثیر قرار میدهد (51). لذا، فهم مکانیسم های تحمل به شوری بسیار با اهمیت است (15). عملکرد گیاهان زراعی تحت تأثیر تنشهای زنده و غیر زنده بیش از 50% کاهش مییابد (146). افزایش شوری خاک یا آب موجب ایجاد اختلال در فرایندهای فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی گیاه شده و باعث بروز مشکلاتی مانند 1) عدم تعادل یونی 2) کمبود مواد معدنی 3) تنش اسمزی 4) سمَیَت یونی و تنش اکسیداتیو میگردد (64). این شرایط با اجزای سلولی همانند DNA، لیپیدها و رنگدانه ها اثر متقابل مییابد (134) و رشد و نموَ اکثر گیاهان زراعی را کاهش میدهد. تحمل نسبت به شوری صفتی چند ژنی است که شامل الف) تقسیم بندی مقادیر زیاد نمک در داخل گیاه ب) تنظیم اسمزی و ج) تغییرات مورفولوژیکی میباشد (84). مطالعاتی که در زمینه تحمل به تنش شوری انجام گرفته است شامل: 1- برنامه های اصلاح کلاسیک که علی رغم برخی موفقیتها، به دلیل ماهیت چند ژنی بودن این صفت محدود گردیده است، 2- استفاده از موتاسیونهایی که منجر به از بین رفتن و حذف عملکرد ژن میگردند برای شناسائی و مطالعه ژنهای مسئول تنش. برای مثال در آرابیدوپسیس، به دلیل سهولت در دستکاری ژنتیکی این گیاه (6)، تحقیقاتی در این زمینه انجام گرفته است و 3- روش های کشت آزمایشگاهی در گیاهانی مانند یونجه (154)، برنج (77 و 155) و سیب زمینی (93) میباشد. توسعه گیاهان دارای پتانسیل ژنتیکی بالقوه برای تحمل نسبت به این تنش، به کاهش استفاده از آب نیز کمک می کند (27). افزایش گیاهان متحمل (124) همراه با مهندسی ژنتیک نتایج خوبی را از نظر احتمال انتقال سریع و دقیق صفات مطلوب به داخل گیاهان مورد نظر، بدون حضور ژن های مضر از خویشاوندان نزدیک گیاه، نشان داده است (111). زیرا در این روش، از انتقال مناطق ناخواسته کروموزومی ممانعت میگردد (112 و 20). استفاده از ظرفیت داخلی گیاه، تحمل آن نسبت به این تنش را تقویت می کند و مهندسی ژنتیک مدرن به انتقال صفات مطلوب کمک مینماید (94).
جو یکی از متحملترین گیاهان زراعی است که طی سالها، از روشهای مختلف فیزیولوژیکی برای تعیین تنوع فنوتیپی تحمل به شوری در این گیاه استفاده شده است (149). ذخایر ژنی جوی زراعی در مقایسه با انواع وحشی آن تنوع ژنتیکی محدودی را نشان دادند که این امر بیانگر لزوم توسعه ارقام سازگار میباشد (105). گزارش شده است که جمعیت هایی که در مناطق تحت تنش شوری رشد مییابند دارای تنوع ژنتیکی گستردهتری هستند (88). از نظر میزان محصول دانه در محیط شور، جو یکی از اعضای متحمل به شوری در تیره تریتیاسه است (69). مکانیسم تحمل به شوری در این تیره عموماً شامل تجمع یون سدیم در طول دوره رشد گیاه میباشد (15 و 138). از نقطه نظر تجمع این یون در تیره تریتیاسه، گیاه جو دارای تنوع ژنتیکی بالایی است. شوری یکی از موانع اصلی افزایش تولید محصول در جو بوده و تحمل به این تنش در مراحل مختلف رشد گیاه متفاوت است. حساسترین مراحل رشد گیاه در مقابل تنش شوری در جو دو مرحله جوانه زنی و گیاهچگی میباشد و با افزایش سن گیاه میزان تحمل آن نیز افزایش مییابد. تأثیر این تنش در مرحله جوانه زنی جو بیشتر مربوط به اثرات یونی است (134)، در حالیکه در مرحله گیاهچگی تنش شوری حاصل اثرات اسمزی میباشد (74). بین تحمل به شوری در دو مرحله رشدی جوانهزنی و گیاهچگی هیچ رابطهای وجود ندارد (74). مکانیسمهای تحمل به شوری در جو شامل موارد زیر است: 1- انتقال یون سدیم از برگهای گیاه جو به داخل واکوئول که موجب کاهش سمَیَت این یون می شود (38) و 2- توزیع بیشتر یون پتاسیم موجود در برگهای جو به داخل سلولهای مزوفیل نسبت به توزیع آنها در سلولهای اپیدرم که موجب افزایش نسبت یونی پتاسیم به سدیم در سیتوپلاسم سلولهای مزوفیل می شود و این وضعیت برای ثبات فتوسنتز با اهمیت است (56).
استراتژی های حفاظت در مقابل آسیب ناشی از شوری در جو عبارت از استراتژی های فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی است. تغییر عملکرد ژن راهی موثر برای تغییر این وضعیت است. بنابراین یک مرحله اساسی، درک مکانیسم مولکولی پاسخ به تنش است که در این مرحله، ژنهای کنترل کننده تنش و گیاهان ترانس ژنیک دارای تحمل بالا نسبت به این تنش شناسایی می گردند (65).
تحمل به شوری در گیاهان می تواند وابسته به عامل انتقال دهنده HKT[1] باشد که این مولکول اختصاصاً انتقال یونهای سدیم یا انتقال یونهای سدیم و پتاسیم را تسهیل مینماید (86 و132) و در تنظیم هموستازی یون سدیم نقش مهمی ایفاء می کند. در آرابیدوپسیس تالیانا تنها یک ژنHKT (144) و در برنج 8 ژنHKT (33 و 48) وجود دارد. این ژن براساس تشابه توالی آمینو اسیدی دارای دو زیر خانواده میباشد (100) که آنها از نظر انتخاب دو یون سدیم و پتاسیم متفاوت هستند ((33، 48 و 72).
خرید اینترنتی فایل کامل :
اعضای ژنی زیر خانواده اول همگی اجزای انتقال دهنده اختصاصی یون سدیم بوده و اعضای زیر خانواده دوم انتقال دهنده همزمان دو یون سدیم و پتاسیم یا انتقال تک یون سدیم و یا پتاسیم می باشند به استثنای ژن OsHKT2,2 (Oshkt2) در برنج.
محققان گزارش دادند که تحمل نسبت به شوری به طور معنی داری با نسبت یون پتاسیم به یون سدیم مرتبط است (105). آنالیز ترکیبی نشان داد که HvHKT1 اصولاً انتقال یون سدیم را تحت شرایط تنش کنترل می کند، که این نتیجه گیری با آنالیز بیشتر بیان ژن تأیید گردید. همچنین گزارش شده است که در جمعیتهایی که در محیط تحت تأثیر تنش رشد مییابند، طیف وسیعی از تنوع ژنتیکی وجود دارد (88). در جو، مطالعه شده است که بیان ژن HKT1 به وسیله یون پتاسیم تنظیم می شود (150). همچنین گزارش شده است که خانوادههای ژن HKT در هموستازی یون سدیم نسبت به یون پتاسیم دخالت مینمایند که این نشان دهنده اهمیت آنها در تحمل نسبت به شوری است (43). چند مکانیسم در سازگاریهای مورفولوژیکی و بیوشیمیایی دخالت دارند که احتمالاً در حفظ نسبت پائین یون سدیم به یون پتاسیم در سیتوپلاسم نقش دارند. در جو (هوردئوم وولگار)، دو تا از این مکانیسمها وجود دارد که شامل انتقال یون سدیم به داخل واکوئول در عرض غشای تونوپلاستی و انتقال یون سدیم به محیط خارج در سراسر غشای پلاسمائی میباشد (32 و 99). توزیع درون سلولی یون سدیم شامل پمپاژ این یون به داخل واکوئول قبل از افزایش غلظت آن در سیتوپلاسم است (138). این فرایند از طریق یک شیب گرادیانت pH که به وسیله جابجایی پروتونی H+-ATPase و پیروفسفاتاز غیر آلی ایجاد میگردد، تسریع می شود (31، 37، 62 و 145). افزایش فعالیت آنتیریپورتر Na+/H+ به دلیل افزایش یون سدیم در ریشه های هوردئوم وولگار گزارش شده است (32). مطالعات متعدد اخیر وجود تنوع در تحمل به شوری در میان ارقام هوردئوم وولگار را گزارش نموده است (66 و 115). تحمل به شوری در گیاهان بستگی به ترانسپورترهای HKT دارد که این ترانسپورترها واسطه انتقال اختصاصی یون سدیم یا انتقال همزمان یون سدیم و پتاسیم هستند. ترانسپورترهای HKT دارای دو نقش میباشند: 1- جذب یون سدیم از محلول خاک برای کاهش یون پتاسیم مورد نیاز هنگامی که یون پتاسیم عامل محدود کننده است و 2- کاهش تجمع یون سدیم در برگها با انتقال آنها به داخل فضای آوند چوبی و یا انتقال آنها به داخل فضای آوند آبکش (113).
تکنیک اکوتیلینگ:
تعیین خصوصیات فنوتیپی جمعیتهای بزرگ یا مجموعههای بزرگ بانک ژنی مشکل و دشوار است. راهحل آن، استفاده از روشی برای صرفه جوئی در زمان و هزینه میباشد. همچنین، توانایی عملی برای تأیید نقش توالیهای ژنی که از طریق برنامه های بررسی بیان توالی ژن در آزمایشات بزرگ به دست میآیند متناسب با سرعت کشف و یافتن آنها نمی باشد. در نتیجه، تعداد زیادی توالی DNA وجود دارد که از طریق تفسیر الکترونیکی با ژنها یا پروتئینهایی که قبلاً خصوصیات آنها تعیین شده همولوژی ندارند و بدین وسیله هیچ عملکرد بالقوهای برای آنها در نظر گرفته نمی شود (11). به علت وجود اطلاعات زیاد در مورد توالیهای ژنی و فقدان آگاهی از عملکرد و نقش آنها، و نیز برای پر کردن فاصله بین ساختار و نقش این توالیها تحقیقات زیادی در زمینه ژنتیک معکوس انجام گرفته است (64). با بهره گرفتن از ابزار مولکولی و ژنتیکی، یک صفت موتانت با یک توالی از DNA که عملکرد آن قبلاً شناخته شده است، مرتبط میگردد (17 و 46). اکوتیلینگ روشی است که با آن میتوان به سرعت و به سادگی پلیمورفیسمهای طبیعی (پلیمورفیسمهای تک نوکلئوتیدی (SNP) یا حذف و اضافههای کوچک) را در ژن مورد نظر تعیین نمود (16). این تکنیک بر مبنای تشخیص موتاسیون است و اولین بار توسط کومای و همکاران معرفی گردید که در واقع از تکنیک تیلینگ برای یافتن موتاسیون در جمعیت طبیعی آرابیدوپسیس تالیانا استفاده گردید. این روش برای جو(Hordeum vulgar L.) (76)، هندوانه (Cucumis melo L.) (91)، گندم(Triticum aestivum L.) (152)، بادام زمینی وحشی (Arachis duranensis K & G) (109) و در تعدادی از گیاهان آبزی مانند (Monochoria vaginalis B.)(151) به کار برده شد. با بهره گرفتن از این روش، تعیین آللهای مختلف ژنهای هدف و کاهش تعداد نمونههایی که باید تعیین فنوتیپ گردند، امکان پذیر می شود. معمولترین شکل تنوع ژنتیکی SNP است، به خصوص آللهای نادری که فراوانی آنها کمتر از 5% است نقش مهمی در فنوتیپ ایفاء مینمایند. اثرات بسیار مؤثر آللهای نادر روی صفات کمّی و بیماریهای پیچیده در تحقیقات زیادی گزارش شده است (14 و 114). برخی از SNP ها از طریق تغییر توالی آمینو اسید یا ناقص کردن پروتئینها عملکرد ژن را تغییر می دهند (109).
هدف از این تحقیق، تعیین تنوع آللی ژنهای کاندیدای تحمل به تنش شوری در ارقام و ژنوتیپهای جو، جستجوی آللهای جدید، آنالیز روابط فیلوژنی میان ژنوتیپهای مورد مطالعه، و طبقه بندی ژنوتیپها در قالب گروه های هاپلوتیپی بوده است. بدین منظور، از تکنیک اکوتیلینگ به کمک توالی یابی[1] که یک تکنیک مدرن و بسیار کارآ میباشد برای یافتن انواع پلیمورفیسمهای نوکلئوتیدی در دو ژن CBL4 و HvHKT1 (ژنهای کنترل کننده تنش شوری) در ارقام مورد مطالعه جو در این تحقیق استفاده گردیده است. این دو ژن در کنترل شوری نقش بسیار مهم و اساسی دارند. در مطالعه حاضر، از تنوع نوکلئوتیدی این ژنها در ارقام و ژنوتیپهای متعلق به مناطق مختلف شور در دنیا برای یافتن منابع جدید و بالقوه تحمل به تنش شوری استفاده شده است. ضرورت انجام چنین تحقیقی این بوده است که علیرغم تحقیقات فراوان در زمینه اصلاحات ژنتیکی و وجود مکانیسمهای سازگاری، بسیاری از گیاهان با مشکل کاهش عملکرد مواجه میباشند. یکی از عوامل اصلی کاهش عملکرد در گیاهان به ویژه گیاهان زراعی، اثرات سوء تنشهای غیر زنده است. از میان تنشهای غیر زنده، تنش شوری یکی از عوامل بسیار مهم کاهش عملکرد و هدر رفتن محصول گیاهی است. لذا، این تحقیق با هدف یافتن منابع بالقوه مقاومت به شوری در ژنوتیپهای جو اجرا گردیده است.
[1] – EcoTILLING by sequencing
[1] – High- affinity K+ transporter
